延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除大鼠胚胎干细胞株的建立

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 50-55.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.008

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延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除大鼠胚胎干细胞株的建立

叶真龙¹，王艳²，金华君²，刘韬^{2，钱其军¹^，²}

1浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所，浙江省杭州市 310018
2解放军第二军医大学东方肝胆医院病毒基因治疗实验室，上海市 200438

收稿日期:2012-04-22 修回日期:2012-05-25 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 钱其军，教授，浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所，浙江省杭州市 310018；解放军第二军医大学东方肝胆医院病毒基因治疗实验室，上海市 200438 qianqj@163.com
作者简介:叶真龙★，男，1987年生，江西省上饶市人，汉族，2012年浙江理工大学毕业，硕士，主要从事大鼠基因敲除的研究。 yzl8766@163.com

Establishment of fumarylacetoacetate hydrolase gene knockout rat embryonic stem cell strains

Ye Zhen-long¹, Wang Yan², Jin Hua-jun², Liu Tao², Qian Qi-jun^1,2

1 Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology, College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, Zhejiang Province, China
2 Laboratory of Viral and Gene Therapy, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200438, China

Received:2012-04-22 Revised:2012-05-25 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Qian Qi-jun, Professor, Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology, College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, Zhejiang Province, China; Laboratory of Viral and Gene Therapy, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200438, China qianqj@163.com
About author:Ye Zhen-long★, Master, Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology, College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, Zhejiang Province, China yzl8766@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：小鼠肝损伤模型已被广泛应用，大鼠肝损伤模型能在发病机制，肝移植环境等方面更好地模拟人，建立大鼠延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fuarylacetoacetat hydrolase，Fah)基因敲除的胚胎干细胞株是大鼠肝损伤模型建立的重点和难点。
目的：建立Fah基因缺失的大鼠胚胎干细胞株。
方法：根据Genbank检索出的大鼠Fah基因序列构建带有正负双向筛选系统的Fah基因敲除载体pKO-Fah，并进行大鼠胚胎干细胞制备与培养，通过电穿孔转染将线性化质粒转入大鼠胚胎干细胞中，用嘌呤霉素和增强型绿色荧光进行克隆的筛选，再对筛选出来的阳性克隆进行PCR验证。
结果与结论：电穿孔转染后观察到绿荧光胚胎干细胞克隆，经过3轮嘌呤霉素药物筛选后约有90%的胚胎干细胞克隆表达绿荧光，成功挑取到2个稳定表达绿荧光的胚胎干细胞克隆，重组胚胎干细胞-Fah，通过PCR鉴定为正确同源重组的阳性克隆。提示大鼠胚胎干细胞稳定建系后，能通过传统的同源重组方法来建立基因敲除胚胎干细胞，并为后期基因敲除动物的建立奠定基础。

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 基因敲除, 同源重组, Fah基因, 大鼠, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Mouse liver injury model has been widely used. The pathological mechanism of liver injury and the environment of liver transplantation in rats can be used for simulation in humans. Establishing fuarylacetoacetat hydrolase gene knockout embryonic stem cell strains is the key to establish a rat model of liver injury.
OBJECTIVE: To establish fuarylacetoacetat hydrolase gene knockout rat embryonic stem cell strains.
METHODS: We first constructed the targeting vector in vitro with positive-negative selective cassette, then transfered the linearized vector into embryonic stem cells through electroporation. We used embryonic stem cell culture medium containing 0.5 μg/mL puromycin to select puromycin resistant clones 36 hours after electroporation, and then we performed PCR to confirm targeted embryonic stem cell clones.
RESULTS AND CONCLUSION: After electroporation, about 90% of embryonic stem cell clones expressed green fluorescence. Two embryonic stem cell clones expressing green fluorescence were selected and confirmed by PCR. The fuarylacetoacetat hydrolase gene deficient rat embryonic stem cell strains were successfully established. This provides evidence for later establishing gene knockout animal models.

Key words: stem cells, embryonic stem cells, gene knockout, homologous recombination, Fah gene, rats, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

叶真龙，王艳，金华君，刘韬，钱其军. 延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除大鼠胚胎干细胞株的建立[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 50-55.

Ye Zhen-long, Wang Yan, Jin Hua-jun, Liu Tao, Qian Qi-jun. Establishment of fumarylacetoacetate hydrolase gene knockout rat embryonic stem cell strains[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 50-55.

图/表（结果） 4

2.1 pKO载体的鉴定 pKO载体的构建对于大鼠基因敲除载体构建是非常重要的，只要在pKO载体上插入目的基因同源臂就可以实现基因敲除载体的构建，pKO载体酶切鉴定结果见图1，鉴定结果与测序结果显示正确。

M: Marker; 1-7: Nde+Nhe Ⅰ, BamH Ⅰ, EcoR Ⅰ, Pst Ⅰ, Hind Ⅲ, XhoⅠ+XmaⅠ, NcoⅠ; 1-7条带: 6.2 kb + 1.5 kb, 4.7 kb + 3.0 kb, 6.9 kb + 0.8 kb, 4.5 kb + 3.2 kb, 6.2 kb + 1.3 kb + 0.24 kb, 6.3 kb + 1.4 kb, 5.4 kb + 1.4 kb + 0.9 kb Figure 1 Agarose analysis of products of pKO restriction enzyme digestion

图1 pKO载体酶切鉴定电泳图

2.2 同源臂的扩增与pKO-Fah的鉴定 5’，3’同源臂长度分别为3 718 bp，1 764 bp，属于大片段扩增，本实验室采用PhusionTM超保真PCR试剂盒，PCR扩增产物回收后电泳结果见图2，结果显示扩增的片段大小与预期相符。实验中两个同源臂之间间隔了Fah基因的exon1，exon2，exon3 3个外显子序列，见图3。pKO-Fah载体的酶切鉴定结果见图4，显示片段大小与预期相符，将酶切鉴定正确的克隆质粒进行测序，测序结果显示正确。同源臂扩增引物见表1。

Figure 2 Agarose analysis of PCR products of homologous arms

图2 同源臂PCR产物电泳结果

M: Marker; 1-7: Nhe Ⅰ, Hind Ⅲ, Kpn Ⅰ, Pst Ⅰ, EcoR Ⅰ, Xba Ⅰ, Xho Ⅰ+Xma Ⅰ; 1-7条带: 9 kb+4.1 kb, 7.8 kb+2.9 kb+1.3 kb+0.9 kb +0.24 kb+0.11 kb, 8.3 kb+4.8 kb, 6.5 kb+4.2 kb + 1.75 kb+0.7 kb, 7.4 kb +2.4 kb+0.8 kb+0.23 kb, 11 kb+2.3 kb, 12 kb+1.41 kb Figure 4 Agarose analysis of products of pKO-Fah restriction enzyme digestion

图4 pKO-Fah载体酶切鉴定电泳结果表1 基因敲除载体构建和PCR鉴定所用的引物

Table 1 Primers used in this study

参考文献

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引言

材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：实验于2010年7月至2011年10月在东方肝胆外科医院基因病毒治疗实验室完成。

材料：第25代大鼠胚胎干细胞，由美国南加州大学应其龙教授惠赠。

滋养层细胞为本所自行制备的经丝裂霉素C预处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)。大肠杆菌DH5α感受态细胞由实验室自行制备。

用原质粒pPyCAGGFPIP做模版，引物E1，E2，KOD-plus对EGFP片段进行PCR，回收800 bp片段。将原始质粒pPyCAGGFPIP和EGFP片段同时进行Xho Ⅰ+Not Ⅰ双酶切并分别回收6 400 bp和800 bp片段用于连接转化，挑取克隆并抽提质粒，再进行酶切鉴定和测序来筛选阳性克隆，得到的阳性重组子命名为P1。

对P1载体上的BGH PolyA片段下游进行Asis Ⅰ，Bgl Ⅱ，Bcl Ⅰ，Sac Ⅰ，Mlu Ⅰ多克隆位点的插入，用质粒pPyCAGGFPIP做模版，引物B1，B2对500 bp大小的BGH片段进行PCR并回收，再将载体P1和回收出来的PCR产物BGH片段同时进行BamH Ⅰ+Cla Ⅰ双酶切，回收酶切产物并连接转化，挑取克隆并抽提质粒，再进行酶切鉴定和测序来筛选阳性克隆，得到的阳性重组子命名为P2。

对载体P2进行负筛选片段PGKDTA的插入，以质粒pTOPOPGKDTA为模版，引物D1，D2对1 000 bp的PGKDTA片段进行PCR扩增，并同时加入Sal Ⅰ，BstB Ⅰ，Asc Ⅰ，Pac Ⅰ多克隆位点，将载体P2和回收出来的PCR产物PGKDTA片段同时进行SpeⅠ+PuvⅡ双酶切，回收酶切产物并作连接转化，挑取克隆并抽提质粒，再进行酶切鉴定和测序来筛选阳性克隆，得到的阳性重组子命名为pKO。

同源臂的插入：以DA大鼠基因组DNA为模版，根据GENBANK检索出来的大鼠Fah基因序列设计引物同源臂PCR引物5F1，5F2和3F1，3F2，用PhusionTM超保真PCR试剂盒分别对5’同源臂(3 718 bp)和3’同源臂 (1 764 bp)进行PCR扩增，并回收目的条带，将回收出来的5’同源臂片段和通用载体pKO一起进行Sal Ⅰ+AscⅠ双酶切，回收酶切产物并连接转化，挑取克隆并提取质粒进行酶切鉴定和测序来筛选阳性克隆，得到的阳性重组子命名为pKO-5’Fah；再将载体pKO-5’Fah和回收出来的3’同源臂片段同时进行Mlu Ⅰ+Asis Ⅰ双酶切，回收酶切产物并作连接转化，挑取克隆并抽提质粒进行酶切鉴定和测序来筛选阳性克隆，得到的阳性重组子命名为pKO-Fah。电穿孔转染之前用限制性内切酶SalⅠ进行线性化备用。

DA大鼠胚胎干细胞的培养和电穿孔转染：将大鼠胚胎干细胞复苏并置于铺好饲养层细胞的24孔板中采用2i小分子培养体系培养，充分重悬后将10⁶-10⁷个胚胎干细胞和20 μg线性化pKO-Fah质粒用不含钙镁离子的PBS混匀，冰浴5 min后在200 V电压，脉冲时间5 ms，脉冲次数为1的条件下进行电转，电转后再冰浴5 min，再将细胞转入铺好MEF细胞的6孔板中培养。

重组胚胎干细胞克隆的筛选和挑取：36 h后将6孔板中胚胎干细胞培养液换成含有0.5 mg/L浓度的Puromycin的2i培养液，并培养48 h后换成普通的2i培养液，这样一个筛选流程记为一轮筛选，共进行3轮筛选直到绝大部分胚胎干细胞克隆均发绿色荧光。这时挑取24个绿色荧光胚胎干细胞克隆至事先预备好的10 μL胰酶微滴消化并吹打，终止消化后直接转入铺好MEF细胞的96孔板中培养并随时观察细胞生长状况，3 d后将所有胚胎干细胞克隆传代并转至铺有MEF的24孔板中培养，密切关注细胞生长并统计每个胚胎干细胞克隆的子代胚胎干细胞克隆的绿色荧光克隆比例。

重组胚胎干细胞克隆的PCR鉴定：按照DNA提取试剂盒说明书中的DNA提取方法分别提取阴性对照胚胎干细胞、3号胚胎干细胞-Fah细胞、5号胚胎干细胞-Fah细胞DNA做PCR鉴定模版。在5’同源臂下游靠近外源整合序列处设计PCR鉴定上游引物FSY，并在原有序列和外源整合序列处分别设计PCR鉴定下游引物FXY和FXYPKO，目的条带大小分别为343 bp和600 bp。

主要观察指标：pKO载体的鉴定；同源臂的扩增与pKO-Fah的鉴定；正确同源重组胚胎干细胞克隆的筛选与PCR鉴定。

讨论

基因打靶是一种基于同源重组的外源DNA导入技术，能将含已知序列的DNA片段，通过同源重组定点整合到受体细胞基因组中，并使外源基因表达^[18]。Fah基因剔除小鼠模型早在1993年由Merkus Grompe课题组建立成功，并利用该小鼠模型做了一序列杰出的工作。2002年，该课题组对Fah基因缺失的小鼠模型进行骨髓移植实验，移植7周后在小鼠受损的肝脏部位检测外源性肝细胞^[19]，该成果进一步证实了骨髓中确实存在一类能向肝细胞分化的细胞群，而且这是一个低效率的漫长过程。2007年，该课题组将Fah基因剔除小鼠与Nod/Scid小鼠杂交并制备Fah^-^/^-/Rag2^-^/^-/Il2rg^-^/^- (FRG)小鼠，再用携带有尿激酶表达基因的腺病毒去感染FRG小鼠进行移植前预处理，预处理之后再进行外源性人肝细胞移植，结果发现外源性的人肝细胞在受损的小鼠肝脏部位增殖并修复了近70%的小鼠肝脏功能，作者同时还进行了一序列的人源性肝细胞标记分析发现，这些新生的肝细胞确实为人源性的，而且都是Fah基因阳性的^[20-22]。综上可知，Fah基因剔除小鼠模型在细胞移植、再殖肝脏研究方面的重要价值，是评价外源性干细胞再殖损伤肝脏的理想动物模型。大鼠在体积、亲缘性、遗传特性和疾病发病机制等多方面与人更为接近，因此在作为动物疾病模型等相关研究方面较小鼠更有优势。故大鼠Fah基因敲除动物模型的建立具有相当重要的意义^[23]。

实验在构建载体的时候考虑到打靶效率会受同源臂长度的影响，虽然理论上同源臂长度与重组效率呈正相关，但同源臂太长会增加整个载体的长度，为了得到最理想打靶效率，扩增的5号同源臂和3号同源臂长度分别为3 718 bp和1 764 bp，同时采用强绿荧光基因(EGFP)、嘌呤霉素基因(Puromycin)和白喉毒素毒性A肽链基因(DTA)来进行正负双向筛选，可以大幅度提高基因打靶的效率。另外还通过3轮嘌呤霉素药物筛选，而且在筛选过程中根据细胞数量可适当提高嘌呤霉素的筛选浓度(0.5-1.0 mg/L)。因为胚胎干细胞对嘌呤霉素敏感性很强，所以一般情况嘌呤霉素筛选浓度为0.5 mg/L就可以杀死绝大部分没发生重组的胚胎干细胞，但是当胚胎干细胞数目增多的时候，真正能进入到胚胎干细胞内的嘌呤霉素会减少，从而降低嘌呤霉素的筛选效果，因此可以适当的提高嘌呤霉素的筛选浓度。经过3轮药物筛选后得到了高达90%绿光表达率的胚胎干细胞克隆群。在高达90%绿光表达率的胚胎干细胞克隆群中，挑选了24个克隆分开培养，得到2个克隆，其子代胚胎干细胞克隆荧光表达率几乎100%。其他22个克隆荧光表达率也均在50%-80%之间，荧光表达率没有达到100%的最主要原因是挑取的胚胎干细胞克隆不是单克隆，而是2个甚至2个以上的胚胎干细胞克隆共同生长形成的克隆，但是一般情况这一类克隆会在体积上超过单个的胚胎干细胞克隆，而且有报道称，这一类大型克隆即使是由单个胚胎干细胞生长形成的，也极大可能是因为染色体畸变从而获得生长优势的克隆，所以在挑取胚胎干细胞克隆的时候可以选择性的挑取体积上比较小的克隆。

综上所述：实验成功构建了正负双向筛选，含有 3 718 bp和1 764 bp大小的同源臂基因敲除载体，并通过PCR鉴定手段成功筛选到Fah基因缺失的大鼠胚胎干细胞株，为后期大鼠Fah基因敲除模型的建立奠定了基础。

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